PCR en Tiempo Real: cuantificación del producto amplificado





En la PCR a tiempo real, la reacción de amplificación se detecta ciclo a ciclo midiendo el incremento de fluorescencia, que es proporcional al aumento de ADN que se va formando en cada ciclo. Esta información se refleja gráficamente en las curvas de cinética de la reacción para cada una de las muestras (Figura). Por tanto, se puede controlar la amplificación al comienzo de la reacción (fase exponencial); en este período la concentración de los reactivos todavíano es limitante y el efecto de la variabilidad en la eficiencia de amplificación es de menor importancia.

Durante las primeras fases de la PCR puede estimarse la concentración inicial de ADN o ARN diana, ya que el aumento de fluorescencia es proporcional a la concentración inicial de ácido nucleico diana presente en la muestra. El primer paso para analizar las curvas de PCR a tiempo real es la determinación de una cantidad fija de fluorescencia, denominada ciclo umbral (Ct, de threshold cycle). Este threshold debe cumplir dos condiciones:

1. Ser significativamente diferente del fondo en los primeros ciclos.
2. Estar en la zona de crecimiento exponencial en las curvas de la cinética de la PCR.

El Ct es inversamente proporcional a la concentración inicial de ADN diana presente en la muestra, siendo la verdadera unidad de medida del producto de la PCR cuantitativa.

Figura. Cinética de la reacción de PCR a tiempo real. En color azul, verde y rojo aparecen cada una de las tres réplicas de las diferentes muestras estudiadas. El control negativo (sin ADNc molde en la mezcla de pcr) de la reacción aparece representado en color negro (ausencia de expresión).