Melting




Curvas de disociación o curvas de melting.


Los equipos para PCR a tiempo real permiten realizar el análisis de las curvas de disociación (curvas de melting) de los productos amplificados por PCR.

Este análisis se basa en la aplicación de un gradiente de temperaturas creciente realizado a continuación de la PCR, obteniéndose una gráfica que se corresponde con la cinética de disociación de los fragmentos amplificados. Mediante esta aplicación se puede determinar la temperatura de melting (Tm, temperatura a la que el 50% del ADN de la molécula está desnaturalizado) de los productos de PCR.

Cada fragmento amplificado tiene una Tm característica, que depende principalmente de la longitud del fragmento y de su composición en nucleótidos. Esta prueba permite diferenciar la fluorescencia correspondiente a la amplificación de un producto de PCR (Tm superior a 80 °C) de la fluorescencia debida a la formación de dímeros de los oligonucleótidos, cuya Tm es más baja (entre 70 y 80 °C) (Ver figura).


Figura. Curvas de disociación del producto amplificado. La Tm de los dímeros está entre 77 °C y 78 °C, los productos amplificados presentan una Tª de 89 °C aproximadamente, mientras que hay una ausencia de pico de melting en las muestras que no han amplificado y el control negativo.